* 高效液相操作通用规程 一、操作程序 1、开机前准备 1.1 检查桌面是否清洁、整齐。 1.2检查设备是否清洁，连接管线是不是正常，色谱柱要不要更换。 1.3检查电源线接通电源，检查插座上各插孔的指示灯是否显示正常。 1.5准备好超声过的流动相和流路冲洗溶剂。 2、开机 2.1 撤下设备停用卡，换上设备运行卡。 2.2 运行检查，打开仪器各部件开关，待机器自检，核实无异常。 2.3 拧松泵右方的快速冲阀（大约2圈左右），按泵前面板右下方的“purge”键 排气泡约2至5分钟左右后，再按“purge”键停止。然后，拧紧快速冲洗 阀。 2.4 打开电脑，并打开软件。 2.5 用色谱纯的甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟左右。若流动相中有盐或酸，再 用95%水（加5%甲醇）冲洗约20分钟。 2.6 换上流动相冲洗流路，待基线和压力稳定后，开始分析样品。 2.7 样品分析完后，处理数据。 2.8 若流动相中有缓冲盐或酸，用95%水冲洗60分钟左右。 2.9 换上甲醇冲洗流路约30分钟。 3、关机 3.1 关闭仪器各部件上的电源开关,并闭电脑。 3.2 拔掉机器电源插头。 4、安全及操作注意事项 4.1 流动相冲洗用的水，必须是重蒸水或2次蒸馏水，并用微孔滤膜过滤，而且要定期更换，防止长细菌堵塞仪器管路。建议每周至少更换两次。 4.2 操作有机溶剂时一律戴一次性手套。 4.3 流动相中有盐或酸时，在流动相冲洗前后一定要用水冲洗流路，防止柱效下 降、堵塞或柱塌陷。 4.4 仪器使用前后一定要用甲醇或乙腈冲洗流路，平衡色谱柱，赶走管路中的杂质和水分。 4.5 流动相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；慎重 使用四氯化碳、、异丙醚、酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈 的腐蚀。 4.6 仪器长期不用时，应用甲醇冲洗各流路。 4.7 检测器的紫外或可见灯在开的情况下，一定要保证有液相流经检测池。若不 需要做样，可设置一个较低的流速（如0.05ml/min）。 5、清洁程序 5.1 停机并切断机器电源。 5.2 松开仪器上各活动面板，用无水酒精定期插洗仪器表面的灰尘和污垢。 5.3 定期更换溶剂瓶中的溶剂过滤头。 5.4 用干净、无纤维抹布擦拭机器，使机体表面光亮清洁，无污迹水渍，机身各 部位无污物残留。 5.5 定期更换蠕动泵头溶剂瓶中的95%水。建议每周至少更换两次。 * * → * * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 高效液相色谱仪使用与操作规程 ??Agilent 1100 HPLC 第一步 第二步 第三步 第四步 准备 开 机 注意 事项 清洁 关机 步 骤 Agilent1100系统组成 本系统由溶剂输送泵（四元泵，标配真空脱气机） Rheodyne 7725i手动进样阀 柱温箱 VWD紫外-可见检测器 Agilent1100色谱数据工作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。 第一步、准 备 1 、准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。 2 、根据待检样品的要换掉合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。 3、 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂） 4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。 接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。 第二步、开 机 一）参数设定 1、 波长设定： 2 、流速设定： 3 、流动相比例设定： 4、 梯度设定： 二）更换流动相并排气泡 1： 将吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中； 2 ：顺时针转动泵的排液阀180°，打开排液阀； 3 ：运行泵，泵以3ml/min的流速冲洗5min（可设定）后泵流速设为0ml/min； 4 ：将排液阀逆时针旋转适度拧紧，关闭排液阀。 5 ：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。 三）平衡系统 用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。 检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。 观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操作。 观察基线变化。如果冲洗至基线mV/min，噪声为0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。 四）进 样 1 、进样前按检测器[balance]键调零，按软件中 [零点校正] 按钮校正基线零点，再按一下 [查看基线 、用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量即可以进样了。 3、含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次 。 五）谱图的判断及结果计算 1、系统适用性实验： ①分离度：一般应≥1.5。 ②重复性：两次谱图的峰面积应相差不的过1%。 ③理论塔板数：应≥规定的理论塔板数目。 ④拖尾因子：0.95＜T＜1.05 ⑤保留时间：对照与样品的主成分保留时间应大致一致。 ⑥RSD： 精密度＜3% 。 2、结果计算 ①外标法： ②内标法： 第三步、清洗管路及关机 1、分析完毕后，先关检测器，再用经滤过和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水（5%甲醇），然后用甲醇-水冲洗，各种冲洗剂一般冲洗15～30分钟，最后用甲醇保留色谱柱，特殊情况应延长冲洗时间。 2、 冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。 3 、关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压，使用小时数，仪器完好状态等。 第四步、需要注意的几点 二、样品 1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒； 2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液； 3、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍； 一、流动相 1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围； 2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质； 3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相； A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。 第四步、注意事项 三、色谱柱 1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等； 2、使用符合要求的流动相； 3、使用保护柱； 4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。 5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存； 6、 不要高压冲洗柱子； 7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱； 使用过程中注意轻拿轻放。 第四步、注意事项 四、操作过程 1、 开机操作： （1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）； （ 2 ）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）； （3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准； （ 4 ）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液； （ 5 ）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。 第四步、注意事项 2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命； 3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果； 4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡； 5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤； 第四步、注意事项 6、 实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯； 7、 关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关； 8、 使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。未经操作培训，不得擅自使用仪器。 第四步、注意事项 四、使用经验交流（1） 1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4、使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 第四步、注意事项 四、使用经验交流（2） 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂(如甲醇)等清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清洗方法：①以异丙醇作溶剂冲洗； ②放在异丙醇中间用超声波清洗； ③用10％稀硝酸清洗。 第四步、注意事项 四、使用经验交流（3） 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。 11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 高效液相色谱仪中常遇见的问题及处理方法 一、 保留时间变化 1.柱温变化 2.等度与梯度间未能充分平衡 3.缓冲液容量不够 4.柱污染 5.柱内条件变化 6.柱快达到寿命 1.柱恒温 2.至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.用25mmol/L的缓冲液 4.每天冲洗柱 5.稳定进样条件,调节流动相 6.采用保护柱 二、 保留时间缩短 1.流速增加 2.样品超载 3.键合相流失 4.流动相组成变化 5.温度增加 1.检查泵,重新设定流速 2.降低样品量 3.流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 4.防止流动相蒸发或沉淀 5.柱恒温 三、 保留时间延长 1.流速下降 2.硅胶柱上活性点变化 3.键合相流失 4.流动相组成变化 5.温度降低 1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.流动相PH值保持在3～7.5检查柱的方向 4.防止流动相蒸发或沉淀 5.柱恒温 四、出现肩峰或分叉 1.样品体积过大 2.样品溶剂过强 3.柱塌陷或形成短路通道 4.柱内烧结不锈钢失效 5.进样器损坏 1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.采用较弱的样品溶剂 3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.更换烧结不锈钢,加在线.更换进样器转子 五、鬼峰 1.进样阀残余峰 2.样品中未知物 3.柱未平衡 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 5.水污染(反相) 1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.处理样品 3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) 4.每天新配,用抗氧化剂 5.通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水 六、 基线.电干扰(偶然噪声) 5.检测器中有气泡 1.流动相脱气,加柱后背压 2.清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 3.更换氘灯 4.采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.流动相脱气,加柱后背压 七、峰拖尾 1.柱超载 2.峰干扰 3.硅羟基作用 4.柱内烧结不锈钢失效 5.柱塌陷或形成短路通道 6.死体积或柱外体积过大 7.柱效下降 1.降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.清洁样品,调整流动相 3.加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品 4.更换烧结不锈钢,加在线.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 6.连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 7.用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 八、峰展宽 1.进样体积过大 2.在进样阀中造成峰扩展 3.数据系统采样速率太慢 4.检测器时间常数过大 1. 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.进样前后排出气泡以降低扩散 3.设定速率应是每峰大于10点 4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% 八、峰展宽 5.流动相粘度过高 6.检测池体积过大 7.保留时间过长 8.柱外体积过大 9.样品过载 5.增加柱温,采用低粘度流动相 6.用小体积池,卸下热交换器 7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.将连接管径和连接管长度降至最小 9.进小浓度小体积样品 . 江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 * 高效液相操作通用规程 一、操作程序 1、开机前准备 1.1 检查桌面是否清洁、整齐。 1.2检查设备是否清洁，连接管线是否正常，色谱柱是否需要更换。 1.3检查电源线接通电源，检查插座上各插孔的指示灯是否显示正常。 1.5准备好超声过的流动相和流路冲洗溶剂。 2、开机 2.1 撤下设备停用卡，换上设备运行卡。 2.2 运行检查，打开仪器各部件开关，待机器自检，核实无异常。 2.3 拧松泵右方的快速冲阀（大约2圈左右），按泵前面板右下方的“purge”键 排气泡约2至5分钟左右后，再按“purge”键停止。然后，拧紧快速冲洗 阀。 2.4 打开电脑，并打开软件。 2.5 用色谱纯的甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟左右。若流动相中有盐或酸，再 用95%水（加5%甲醇）冲洗约20分钟。 2.6 换上流动相冲洗流路，待基线和压力稳定后，开始分析样品。 2.7 样品分析完后，处理数据。 2.8 若流动相中有缓冲盐或酸，用95%水冲洗60分钟左右。 2.9 换上甲醇冲洗流路约30分钟。 3、关机 3.1 关闭仪器各部件上的电源开关,并闭电脑。 3.2 拔掉机器电源插头。 4、安全及操作注意事项 4.1 流动相冲洗用的水，必须是重蒸水或2次蒸馏水，并用微孔滤膜过滤，而且要定期更换，防止长细菌堵塞仪器管路。建议每周至少更换两次。 4.2 操作有机溶剂时一律戴一次性手套。 4.3 流动相中有盐或酸时，在流动相冲洗前后一定要用水冲洗流路，防止柱效下 降、堵塞或柱塌陷。 4.4 仪器使用前后一定要用甲醇或乙腈冲洗流路，平衡色谱柱，赶走管路中的杂质和水分。 4.5 流动相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；慎重 使用四氯化碳、、异丙醚、酮、甲基环己胺等，防止造成对柱塞密封圈 的腐蚀。 4.6 仪器长期不用时，应用甲醇冲洗各流路。 4.7 检测器的紫外或可见灯在开的情况下，一定要保证有液相流经检测池。若不 需要做样，可设置一个较低的流速（如0.05ml/min）。 5、清洁程序 5.1 停机并切断机器电源。 5.2 松开仪器上各活动面板，用无水酒精定期插洗仪器表面的灰尘和污垢。 5.3 定期更换溶剂瓶中的溶剂过滤头。 5.4 用干净、无纤维抹布擦拭机器，使机体表面光亮清洁，无污迹水渍，机身各 部位无污物残留。 5.5 定期更换蠕动泵头溶剂瓶中的95%水。建议每周至少更换两次。 * * → * * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易 * 突然容易

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